远志皂苷元通过 Nrf2/HO-1 通路抑制脑出血体外细胞模型 BV2 小胶质细胞炎症的机制研究

来源期刊：广州医药 | 729-737 发布时间：2026-06-20 收稿时间：2026/7/7 17:07:35 阅读量：92

作者：: 项元元,

卢育涛,

曹先明,

陈志颖,

关键词：: 远志皂苷元脑出血 BV2细胞 Nrf2/HO-1通路炎症; tenuigenin intracerebral hemorrhage BV2 Cells Nrf2/HO-1 Pathway inflammation

DOI：: 10. 20223 / j. cnki. 1000-8535. 2026. 06. 009

收稿时间：: 2025-11-24
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目的探索Nrf2/HO-1通路是否参与远志皂苷元（远志）在脑出血体外细胞模型中对BV2小胶质细胞炎症反应的调控作用。方法采用红细胞与BV2小鼠小胶质细胞共培养构建体外脑出血模型。分别给予远志单独处理、远志联合Nrf2抑制剂ML385处理，检测炎症因子水平。收集细胞上清制备条件培养基，用于培养SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞，并检测其铁死亡水平。结果模型组BV2细胞炎症因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）水平较对照组显著升高（P＜0.001）；高浓度远志（20 μM）可降低炎症因子水平，并上调Nrf2/HO-1通路蛋白表达，而ML385能逆转该作用。模型组条件培养基可诱导SH-SY5Y细胞铁死亡，而经远志处理的BV2细胞条件培养基则减轻该现象；ML385预处理可削弱远志对SH-SY5Y细胞的保护作用，远志组铁离子、丙二醛、转铁蛋白受体1水平低于远志联合ML385组（P＜0.05），铁转运蛋白、谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶水平高于远志联合ML385组（P＜0.05）。结论远志皂苷元通过激活Nrf2/HO-1通路抑制BV2小胶质细胞炎症反应，并在脑出血体外模型中发挥神经保护作用。

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种临床常见的致残率和致死率均极高的急性脑血管疾病，其病理损害主要源于以下两方面：血肿扩张引起的原发性损伤和由血液成分诱导的病理反应引起的继发性损伤，二者均严重危害患者生命健康^［1］。其中，脑出血后，血肿成分中红细胞裂解释放的大量毒性物质所引起的局部微环境改变及继发性反应，是继发性神经损害的主要病理机制^［2］，包括炎症、氧化应激、兴奋性毒性和细胞毒性等多重环节^［3］。继发性脑损害直接关系到疾病的预后，目前尚无有效的治疗方法。因此，深入阐明其病理机制并探寻新的干预靶点，具有重要的临床与科学意义。

小胶质细胞是脑内关键的先天免疫细胞，也是在包括脑出血在内的多种急性脑损伤中最早被激活的细胞类型之一^［4］。在急性脑损伤刺激下，小胶质细胞迅速激活并发生表型极化，主要呈现促炎性的M1表型或抗炎性的M2表型。已有研究表明，抑制M1型活化并促进M2型极化，可增强对红细胞和细胞碎片的清除能力，减轻炎症相关的继发性神经损伤，并促进神经修复^［5-7］。然而在脑出血早期，小胶质细胞主要释放促炎介质，而具有神经保护作用的抗炎表型往往受到抑制^［8］。因此，调控小胶质细胞的炎症反应方向可能成为缓解脑出血后神经损伤的重要治疗策略。

远志皂苷元是中药远志的主要活性成分之一，已被证实具有抗氧化应激、抗细胞凋亡和抗炎等多种药理作用^［9-11］。最新的研究发现，远志皂苷元主要活性成分Tenuigenin可减轻脑水肿的发展，从而改善ICH小鼠的神经功能^［12］。我们前期的研究发现，在大鼠脑出血模型中，激活Nrf2/HO-1信号通路能够抑制小胶质细胞早期活化及其促炎反应，并显著改善神经行为学评分^［13］。但远志皂苷元能否通过Nrf2/HO-1信号通路调控脑出血后小胶质细胞的极化和炎症反应尚未见报道。

本研究通过红细胞与BV2小胶质细胞共培养构建体外脑出血模型，以模拟红细胞毒性作用。经远志皂苷元干预，利用ML385抑制Nrf2，通过上清液炎性因子水平的检测来评估小胶质细胞极化状态，并将该上清液作为条件培养基作用于SH-SY5Y细胞，随后检测铁死亡相关指标。尽管未来仍需通过动物体内实验进一步验证，但本研究有望阐明远志皂苷元通过调控Nrf2/HO-1信号通路影响小胶质细胞炎症反应，从而干预脑出血进程的分子机制，为脑出血的中医药治疗提供新的理论依据和研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

远志皂苷元（上海源叶生物科技），小鼠红细胞（南京森贝伽生物科技），BV2小鼠小胶质细胞系（中国医学科学院细胞中心），SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（湖南丰晖生物科技），DMEM 完全培养基，MEM 培养基，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco公司），RIPA裂解液，二辛可酸法（bicinchoninic acid assay ，BCA）试剂盒，LDH 细胞毒性检测试剂盒（碧云天），DMSO，双抗，MTT （Sigma-Aldrich），炎症因子相关酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（ABclonal），Nrf2、HO-1、β-actin、铁转运蛋白（ferroportin，FPN）、转铁蛋白受体（transferrin receptor protein 1，TFR1）抗体（Abcam），ML385（AbMole）。铁测定试剂盒（武汉艾美捷）、MDA ELISA 试剂盒和GSH ELISA 试剂盒（南京建成）、GPX4 ELISA 试剂盒（上海酶联）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BV2细胞使用含10% FBS和1%的青霉素和链霉素混合液的DMEM完全培养基在37 ℃，5% CO₂的细胞培养箱中培养。SH-SY5Y细胞使用含10% FBS和1%的青霉素和链霉素混合液的MEM培养基培养。

1.2.2 脑出血体外模型构建及干预参考之前的研究^［14］，按红细胞∶BV2细胞1∶10的比例将红细胞加入BV2细胞培养液共培养6 h，建立BV2小胶质细胞脑出血模型，0.1、1、5、10、20 μM梯度浓度远志皂苷元加入培养24 h。设20 μM浓度的ML385为Nrf2抑制剂组，对照组加入等体积的溶剂DMSO。收集各组细胞上清液，300 g离心10 min去除细胞碎片沉淀，所得上清液用于ELISA等实验或者制作SH-SY5Y 细胞条件培养基，培养皿中细胞即可提蛋白用于检测某些蛋白的表达。

1.2.3 细胞活力检测以4×10个/孔密度接种BV2细胞到96孔板，100 μL/孔。设空白组、对照组、模型组以及远志皂苷元各浓度梯度干预组，每组设3个复孔。空白组仅含培养液，对照组为细胞与培养液，模型组加红细胞，远志皂苷元各浓度梯度干预组同时加红细胞和各浓度远志皂苷元。干预24 h后，每孔留90 μL培养基，加入噻唑蓝［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT；5 mg/mL］，孵育4 h后，用150 μL DMSO替换培养基，在酶标仪上于490 nm波长处测定吸光度。

1.2.4 乳酸脱氢酶检测试验每孔取120 μL细胞上清液加到96孔板中，设置空白对照孔与最大酶活性对照孔。空白对照孔加入无细胞的培养液，最大酶活性对照孔在收集细胞上清液前1 h，加入试剂盒中的原培养基体积10%的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放试剂。根据当次实验所需的量，按照乳酸溶液：1×INT溶液：酶溶液=1∶1∶1的比例配制LDH检测工作液，按照60 μL/ 孔的量加入LDH检测工作液，混匀后室温避光孵育30 min，在酶标仪上检测490 nm的吸光度。细胞毒性=（加药组样本吸光度-对照组样本吸光度）/（最大酶活性对照孔吸光度-对照组样本吸光度）。

1.2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）实验前，统一标准收取细胞上清液或者提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白量。根据ELISA试剂盒说明书，在酶标微孔板中，依次加入标准品、待测样本以及生物素化抗体，经过孵育，标准品与待测样本中所含的目标蛋白能够同时与酶标板上包被的抗体以及生物素化的抗体发生特异性结合。孵育结束后洗板，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，再加入TMB显色底物后，生成蓝色产物。加入终止液终止反应，于450 nm波长处测定吸光度，通过绘制标准曲线，即可计算出培养液或细胞中目标蛋白的浓度。

1.2.6 蛋白质免疫印迹细胞弃去培养液，用预冷PBS洗去残留培养液，随后加入RIPA裂解液，收集细胞至1.5 mL EP管。超声，按照BCA蛋白定量试剂盒操作说明检测浓度。将样本按计算比例加上样缓冲液后煮沸5 min，取35 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，分别使用80 V和120 V电压在浓缩胶和分离胶中电泳。300 mA转膜2 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗3次后加入稀释好的一抗（1∶1 000），4℃冰箱中孵育过夜。次日回收一抗，TBST洗3次，加入稀释好的二抗（1∶10 000），室温孵育2 h。TBST洗3次，奥德赛扫膜仪。以β-actin为内参，条带灰度值通过Image J进行分析。

1.3 数据统计分析

以均值±标准差

的形式呈现结果，采用单因素方差检验比较组间差异，使用Prism 8.0进行数据分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度远志皂苷元对BV2细胞存活的影响

MTT法检测结果显示，与对照组相比，0.1~20 μM的远志皂苷元处理的BV2细胞活力无明显变化（见图1a，P＞0.05），同时LDH检测试验结果也显示0.1~20 μM的远志皂苷元不会对BV2细胞造成毒性（见图1b，P＞0.05）。加入红细胞诱导BV2细胞脑出血模型后，再次通过MTT法和LDH检测试验检测远志皂苷元的干预效果，结果显示红细胞加入后会导致模型组细胞活力降低，细胞毒性升高，而高浓度（20 μM）的远志皂苷元能促进红细胞处理后BV2细胞的活力恢复，并且减少细胞毒性（见图1c-d，P＜0.05）。以上结果说明，远志皂苷元具有浓度依赖性细胞保护作用。

图 1 远志皂苷元对 BV2 细胞以及 BV2 脑出血模型细胞存活的影响

注：（a-b）不同浓度梯度的远志皂苷元培养24 h后BV2细胞的活力和毒性检测；（c-d）BV2脑出血模型和低浓度（1 μM）和高浓度（20 μM）远志皂苷元培养24 h后BV2细胞的活力和毒性检测。^**P＜0.01，^***P＜0.001，ns，not significant，n=4。

2.2 高浓度（20 μM）远志皂苷元处理降低BV2小胶质细胞脑出血模型的炎症反应

随后提取各组，细胞上清液，采用ELISA法检测炎症因子含量，结果显示，与对照组相比，模型组细胞上清液中促炎因子IL-1β、IL-6或TNF-α的表达水平升高，而高浓度（20 μM）的远志皂苷元能显著减少红细胞造模处理后BV2细胞上清液中的炎症因子水平（见图2a-c，P＜0.05）。以上结果说明，高浓度（20 μM）的远志皂苷元可以抑制BV2小胶质细胞的促炎性极化，降低脑出血模型中炎症因子的大量释放。

图 2 远志皂苷元对 BV2 细胞脑出血模型炎症反应的影响

注：（a-c）低浓度（1 μM）和高浓度（20 μM）的远志皂苷元培养12 h后BV2脑出血模型细胞上清液的炎症因子IL-1β、IL-6和

TNF-α的含量检测。^* P＜0.05，^***P＜0.001，ns，not significant，n=4。

2.3 高浓度远志皂苷元（20 μM）对Nrf2/HO-1信号通路的调控作用

为了进一步探索高浓度（20 μM）远志皂苷元调控脑出血模型BV2小胶质细胞炎症反应的机制，我们对正常组、模型组、模型+PBS组、模型+远志皂苷元（1 μM）组、模型组+远志皂苷元（20 μM）组细胞提取蛋白，进行了Nrf2和HO-1的蛋白表达水平检测。结果显示，与对照组相比，模型组细胞Nrf2和HO-1的蛋白表达水平升高，而高浓度（20 μM）的远志皂苷元能进一步上调经红细胞造模处理后BV2细胞中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平（见图3a-c，P＜0.05）。以上结果说明，高浓度（20 μM）的远志皂苷元可以上调Nrf2/HO-1通路蛋白表达。

图 3 远志皂苷元对 BV2 细胞脑出血模型 Nrf2/HO-1 通路的影响

注：（a-c）低浓度（1 μM）和高浓度（20 μM）的远志皂苷元培养24 h后BV2脑出血模型细胞的Nrf2/HO-1的蛋白水平检测，Western blot条带典型图和统计图。^*P＜0.05，^***P＜0.01，ns，not significant，n=3。

2.4 Nrf2抑制剂干预后降低高浓度远志皂苷元的抗炎作用

为了确定高浓度（20 μM）的远志皂苷元通过Nrf2来调控BV2小胶质细胞极化，我们在远志皂苷元的基础上加入20 μM Nrf2抑制剂ML385处理，检测细胞活力与毒性及上清液中炎症因子IL-1β、IL-6或TNF-α的表达水平。结果显示，ML385处理降低了模型组细胞活力，增加了细胞毒性，并促进细胞上清液的IL-1β、IL-6或TNF-α的表达水平的升高，与模型组+远志皂苷元（20 μM）+DMSO组相比，模型组+远志皂苷元（20 μM）+ML385组细胞活力降低（见图4a，P＜0.01），毒性增加（见图4b，P＜0.01），并且细胞上清液的IL-1β、IL-6或TNF-α的表达水平升高（见图4c-e，P＜0.05）。以上结果说明Nrf2抑制剂ML385显著地降低了高浓度远志皂苷元的抑炎效果，表明Nrf2参与了高浓度（20 μM）的远志皂苷元调控BV2小胶质细胞极化。

图 4 Nrf2 抑制剂 ML385 对高浓度（20 μM）远志皂苷元抗炎效果的影响

注：（a-b）Nrf2抑制剂ML385处理后BV2脑出血模型细胞的活力和毒性检测；（c-e） Nrf2抑制剂ML385处理后BV2脑出血模型细胞培养液的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的检测。^* P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，n=4。

2.5 高浓度远志皂苷元处理后上清液作为条件培养基可抑制SH-SY5Y细胞铁死亡

然后，为了进一步探索高浓度（20 μM）远志皂苷元作用于BV2小胶质细胞脑出血模型后可能对神经元的影响，我们收集高浓度（20 μM）远志皂苷元处理后的BV2小胶质细胞脑出血模型的细胞上清液作为条件培养基，加入已培养的SH-SY5Y细胞，6 h后提取细胞蛋白检测铁死亡的相关指标。ELISA结果显示，与脑出血细胞模型组相比，模型组+远志皂苷元（20 μM）处理组SH-SY5Y细胞的铁含量与丙二醛（malondialdehyde，MAD）含量降低，谷胱甘肽（glutathione，GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPX4）含量升高，Western blot结果显示FPN表达升高，而TfR1蛋白表达降低，以上结果说明模型组+远志皂苷元（20 μM）处理组SH-SY5Y细胞的铁死亡水平降低（如图5a-g，P＜0.05），而与模型组+远志皂苷元（20 μM）处理组相比，模型组+远志皂苷元（20 μM）+ML385组SH-SY5Y细胞的铁含量和MDA升高，GSH和GPX4含量降低，Western blot结果显示FPN蛋白表达降低，而TfR1蛋白表达升高，以上结果说明模型组+远志皂苷元（20 μM）处理组SH-SY5Y细胞的铁死亡水平升高（见图5a-g，P＜0.05）。因此我们推测，高浓度（20 μM）远志皂苷元除了抑制脑出血模型BV2细胞炎症反应，还可以间接降低SH-SY5Y细胞铁死亡，提示高浓度远志皂苷元具有一定的神经保护作用。

图 5 BV2 脑出血模型细胞高浓度（20 μM）远志皂苷元干预后细胞上清液作为条件培养基对于 SH-SY5Y 细胞铁死亡的影响

注：（a-d）各组SH-SY5Y细胞中铁、MDA、GSH和GPX4水平；（e-g）各组SH-SY5Y细胞中铁转运蛋白（FPN）和转铁蛋白受体

（TFR1）蛋白水平的检测，Western blot条带典型图和统计图。^*P＜0.05，^**P＜0.01，n=3。

3 讨论

ICH是脑实质内非创伤性血管破裂导致的出血性事件，具有起病急骤、病情危重、致死率和致残率高等特征，常导致严重神经功能缺损及不良临床结局。ICH的病理过程可分为原发性脑损伤与继发性脑损伤^［15］。其中，继发性脑损伤主要由血液成分诱导的氧化应激驱动，活性氧过量生成及其介导的细胞毒性在此过程中发挥关键作用。目前ICH的临床治疗主要依赖神经外科手术清除血肿以缓解占位效应^［16］，然而，针对继发性脑损伤仍缺乏有效干预手段。

研究表明，多种中药可通过改善脑出血后的神经毒性、炎症反应、氧化应激、血脑屏障完整性、细胞凋亡及神经功能障碍，从而减轻脑组织损伤^［17］。在 ICH 病程中，铁代谢紊乱、脂质过氧化、氧化应激与神经炎症共同驱动铁死亡，成为继发性脑损伤的关键机制。中药干预策略（包括草药、活性成分及针灸等）可通过调节铁稳态、抑制氧化应激等途径对抗上述病理过程，从而改善神经功能预后^［18-20］。远志皂苷元是远志的主要活性成分，已被证实具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和神经营养等多种药理作用，在抑郁症^［21］、帕金森病^［22-24］和消化道疾病^［25］中表现出保护效应，尤其在神经系统疾病领域展现出显著的治疗潜力^［26］。

最新研究发现，远志皂苷元主要活性成分Tenuigenin减轻脑水肿的发展，从而改善 ICH小鼠的神经功能^［12］。然而，其具体作用机制尚未明确。本研究重点探讨了远志皂苷元对脑出血小胶质细胞模型的干预作用：通过红细胞诱导小鼠BV2小胶质细胞建立体外ICH模型，并采用不同浓度的远志皂苷元进行处理。首先，通过MTT法和ELISA检测发现，不同浓度远志皂苷元处理24小时后，BV2细胞活力及培养液中细胞毒性水平均未发生显著变化，提示该成分在实验条件下具有较好的生物安全性。进一步实验表明，红细胞诱导的BV2脑出血体外模型中，促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平显著上升，提示细胞炎症反应水平升高；而较高浓度（20 μM）远志皂苷元干预后，这些促炎因子水平明显降低，说明其能有效抑制脑出血体外模型中BV2细胞炎症反应。

小胶质细胞的极化状态是调控脑出血后神经炎症反应及血肿清除的关键环节。本研究结果提示，远志皂苷元可能通过抑制小胶质细胞炎症反应，干预脑出血后继发性脑损伤提供潜在治疗策略。为深入阐明其作用机制，本研究进一步探讨了Nrf2/HO-1信号通路的作用。Nrf2作为调控氧化应激与抗炎反应的核心转录因子，其激活可产生抗氧化、抗炎及神经保护等多重效应^［27］。Western blotting结果显示，与正常对照组相比，脑出血模型组中Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达表达上调；而经高浓度远志皂苷元干预后，该通路相关蛋白表达进一步显著上调，提示远志皂苷元具有激活Nrf2/HO-1通路的作用。多项研究表明，Nrf2激活剂（包括天然及合成化合物）在神经退行性疾病中具有治疗潜力。此外，在多种缺血性卒中动物模型中，Nrf2激活剂可减轻脑损伤。近期研究提示，Nrf2激活剂对颅内出血亦具有潜在治疗价值，未来有望用于脑出血患者的临床干预^［28］。例如，新型Nrf2激活剂omaveloxolone在脑出血小鼠模型中可抑制小胶质细胞M1型极化，促进M2型表型激活，并改善感觉运动功能^［29］。

Nrf2激活剂RS9可减轻脑出血小鼠模型在亚急性期的继发性脑损伤，具体表现为脑水肿减轻、神经功能缺损改善及神经元损伤范围缩小^［30］。为明确远志皂苷元是否通过Nrf2通路调控脑出血模型中小胶质细胞炎症反应，本研究联合使用了Nrf2抑制剂ML385。结果显示，ML385可显著削弱高浓度远志皂苷元的抗炎作用，导致培养液中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平回升。结果表明，Nrf2/HO-1信号通路在远志皂苷元调节脑出血后小胶质细胞极化中起关键作用。

此外，有研究表明铁死亡在脑出血的病理进程中发挥重要作用，并参与继发性脑损伤的发生^［31］，药物抑制或靶向干预铁死亡可有效减轻脑出血后继发性脑损伤^［32-34］。为此，本研究将模型组、模型组+远志皂苷元（20 μM）及模型组+远志皂苷元（20 μM）+ML385组的细胞培养上清作为条件培养基处理SH-SY5Y细胞，以评估其对神经元细胞铁死亡的影响。结果显示，远志皂苷元（20 μM）可降低SH-SY5Y细胞的铁死亡水平，而Nrf2抑制剂ML385则削弱该保护作用。以上结果提示远志皂苷元（20 μM）可能通过间接途径调控神经元铁死亡，推测其机制与通过Nrf2/HO-1通路调节BV2细胞的促炎性分泌表型相关，但其对神经元的保护效应确切机制仍有待阐明。此外，本研究尚存在一定局限性。本研究未在脑出血动物模型中对远志皂苷元是否通过Nrf2/HO-1通路调控小胶质细胞炎症反应及减轻铁死亡验证，这是后续研究的重要方向。

综上所述，本研究通过体外实验证实，远志皂苷元能够激活脑出血体外模型BV2小胶质细胞的Nrf2/HO-1通路，并降低炎症因子释放。经该药物处理的BV2细胞上清液可减轻SH-SY5Y神经元的铁死亡，且此保护作用可被Nrf2抑制剂逆转。该结果为脑出血的药物治疗提供了新靶点，后续需通过动物实验进一步验证其临床转化潜力。

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